winner802光子相關(guān)納米粒度儀的應(yīng)用

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生化診斷是醫(yī)院檢驗(yàn)科最為常見的診斷平臺(tái)，具有準(zhǔn)確度高、精密度好及試劑性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，而膠乳增強(qiáng)免疫比濁法又是生化診斷平臺(tái)中運(yùn)用最為廣泛的一種方法，能大大提高生化檢驗(yàn)的分析靈敏度，在臨床診斷中得到了廣泛的運(yùn)用。

膠乳致敏顆粒的制備過程如下：將抗體與聚苯乙烯納米羧基微球在特定的緩沖液中孵育，加入一定量羧基活化劑，使得IgG分子N-端的氨基與微球表面的羧基發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)，形成牢固的酰胺鍵，最終微球表面被包被了一層IgG，可與人血清樣本中相應(yīng)的抗原發(fā)生抗原抗體反應(yīng)而致敏。然而在包被抗體過程中，由于所處緩沖體系的變化、包被IgG等電點(diǎn)與Buffer PH相近等原因，微球表面原先的電荷平衡會(huì)被打破，導(dǎo)致納米微球粒子之間會(huì)發(fā)生一些可逆性的聚集，使得納米微球粒徑增大為裸球的幾倍甚至數(shù)十倍，直至微球聚集沉淀。同時(shí)，由于顆粒之間的聚集程度不一致，導(dǎo)致整個(gè)膠體溶液體系的均一性很差，分散度不好。

粒徑增大及分散度變差的膠乳致敏顆粒會(huì)嚴(yán)重影響試劑的性能，如靈敏度降低、線性范圍變窄及穩(wěn)定性變差等。這時(shí)，除了選擇合適的膠乳儲(chǔ)存液之外，我們還需要用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)將團(tuán)聚的膠乳顆粒用超聲波打散并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其粒徑及分散指數(shù)的變化，直至其下降到能滿足試劑相應(yīng)的性能指標(biāo)要求為止。然而，如果超聲能量過大或者時(shí)間過長(zhǎng)，雖然能使微球粒徑及分散指數(shù)降至很低的水平甚至接近裸球的水平，但是超聲波的高能量會(huì)對(duì)微球表面包被的IgG分子有一定的破壞，使得致敏膠乳顆粒失效。綜上所述，我們?cè)诔曔^程中需要不斷監(jiān)測(cè)膠乳顆粒粒徑及分散指數(shù)的變化，找到一個(gè)合適的范圍，既能保證試劑的各項(xiàng)性能指標(biāo)要求，又能及時(shí)終止超聲過程以減少其對(duì)IgG分子的破壞，保證抗體的生物活性。

本研究以人血清肌紅蛋白檢測(cè)用致敏膠乳顆粒的制備過程為例，通過大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)闡明在膠乳顆粒制備過程中粒徑及分散指數(shù)的控制對(duì)最終試劑性能的影響。

本研究中用到的主要原料及儀器如下：

原料及儀器名稱

廠家

規(guī)格/批號(hào)/型號(hào)

羊抗人肌紅蛋白多克隆抗體

北京阿匹斯生物生物技術(shù)有限公司

批號(hào)：20160506

聚苯乙烯羧基納米微球

JSR Life Sciences

規(guī)格：P0219

超聲波細(xì)胞破碎機(jī)

南京先歐儀器制造有限公司

型號(hào)：XO-900D

粒徑分析儀

濟(jì)南微鈉

型號(hào)：Winner 802

全自動(dòng)生化分析儀

長(zhǎng)春迪瑞

CS-1200

 

本研究的實(shí)驗(yàn)方法如下：將制備好的人血清肌紅蛋白檢測(cè)用致敏膠乳顆粒進(jìn)行冰浴超聲，每隔10min取樣測(cè)試粒徑（單位為nm）及分散指數(shù)（以粒徑儀測(cè)值*10000表示）（粒徑儀事先進(jìn)行校準(zhǔn)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

    由上圖可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑及分散度迅速下降，約20min之后達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，粒徑及分散度下降緩慢。

選取每一個(gè)超聲時(shí)間點(diǎn)的致敏膠乳顆粒，測(cè)試試劑線性范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，致敏膠乳顆粒的粒徑及分散指數(shù)逐漸降低，對(duì)應(yīng)試劑的線性范圍逐漸變寬，分析原因如下：當(dāng)膠乳致敏顆粒粒徑及分散度較大時(shí)，在體系中顆粒聚集在一起，反應(yīng)梯度不明顯，整體吸光度值都很高；超聲打散膠乳顆粒后，接近單個(gè)粒子的膠乳體系與抗原反應(yīng)時(shí)能形成很強(qiáng)的濁度，是線性范圍變得很寬，且打散后的膠乳顆?？贵w暴露的更完全，免疫反應(yīng)很強(qiáng)，吸光度值更高；繼續(xù)超聲，雖然粒徑及分散度降的更低，但包被的IgG分子一定程度上被超聲波的高能量所破壞，導(dǎo)致線性范圍變窄，低值靈敏度及高值可報(bào)告范圍均變差。

    同樣選取每個(gè)超聲時(shí)間點(diǎn)的致敏膠乳顆粒，測(cè)試試劑在37℃熱環(huán)境下的穩(wěn)定性，測(cè)試一個(gè)月，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著超聲波打散的進(jìn)行，致敏膠乳顆粒的粒徑及分散指數(shù)逐漸降低，試劑的熱穩(wěn)定性也呈現(xiàn)出一定的規(guī)律：0min及10min兩組由于粒徑過大，膠乳顆粒直接聚集沉淀，無法測(cè)試穩(wěn)定性；20min由于膠乳顆粒沒有處于完全打散狀態(tài)，顆粒會(huì)有逐步緩慢聚集的過程，穩(wěn)定性測(cè)試表現(xiàn)為上升的趨勢(shì)并在28天的時(shí)候聚集沉淀；30minn時(shí)膠乳顆粒的粒徑及分散度處于最佳的水平，試劑性能較為穩(wěn)定；隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，IgG分子的破壞越來越明顯，導(dǎo)致試劑不穩(wěn)定。

綜上所述，在致敏膠乳顆粒制備過程中需要通過超聲波打散凝集的膠乳，而粒徑及分散指數(shù)的監(jiān)測(cè)可以作為衡量超聲效果的很好指標(biāo)。在本研究中，肌紅蛋白致敏膠乳顆粒制備的最佳超聲時(shí)間是30min，此時(shí)的粒徑為274nm，分散指數(shù)為0.0426，此時(shí)的試劑性能最佳。             

然而，不同的項(xiàng)目可能表現(xiàn)為不同的超聲時(shí)間、最佳粒徑及分散指數(shù)，但是都會(huì)有以下的規(guī)律：致敏膠乳顆粒粒徑及分散指數(shù)過大時(shí)，整個(gè)體系不穩(wěn)定，膠乳顆?？赡軙?huì)聚沉，試劑性能較差；粒徑及分散指數(shù)過低時(shí)，高強(qiáng)度的超聲波可能會(huì)破壞IgG分子的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致試劑性能變差。所以我們需要通過超聲控制合理的粒徑及分散指數(shù)，使得試劑性能達(dá)到一個(gè)最佳狀態(tài)。在每一個(gè)項(xiàng)目的研發(fā)上，我們可能都需要找到致敏膠乳顆粒的最佳粒徑及分散指數(shù)，以及時(shí)終止超聲過程，保證試劑的最佳性能。